뇌 세포 간의 연결과 작동원리는 20세기 초부터 꾸준히 연구되어 왔지만 수천 개에서 수백억 개의 신경세포가 복잡하게 얽혀있는 뇌를 연구하기는 쉽지 않다. 이런 복잡한 뇌의 연결구조를 빛을 이용하여 눈으로 볼 수 있게 만든 연구가 국내 유치 해외 연구진에 의해 개발되었다.

한국과학기술연구원(KIST, 원장 문길주) 기능커넥토믹스연구단 조지어거스틴(George Augustine) 박사팀이 수행한 이번 연구는 미래창조과학부와 한국연구재단이 추진하는 세계수준의 연구센터(WCI) 사업의 일환으로 수행되었으며, 신경과학 분야의 권위있는 학술지인 ‘Journal of Neuroscience’ 10월호에 게재되었다.(논문명 : Visualization of Synaptic Inhibition with an Optogenetic Sensor Developed by Cell-Free Protein Engineering Automation)

뇌가 제 기능을 수행하는데 가장 기본이 되는 시냅스. 시냅스는 흥분성 시냅스와 억제성 시냅스로 구분되는데 두 개의 시냅스가 균형을 이룰 때 신경회로는 정상적인 기능을 할 수 있다. 시냅스간의 소통은 +와 - 성질을 가진 이온의 교환을 통해 이루어지는데, 억제성 시냅스가 활성화 되는지 여부는 세포 내의 염소 이온(Cl-)의 농도 변화에 의해 조절된다. 따라서 신경세포 내의 염소 이온의 농도 측정은 억제성 신경망 연구에 매우 중요하다.

※ 흥분성/억제성 시냅스 : 하나의 신경세포가 다른 신경세포를 흥분시키느냐 억제시키느냐에 따라서 흥분성 시냅스와 억제성 시냅스로 분류된다

연구진은 이온 농도 측정을 위해 빛을 이용했다. 빛은 파장에 따라 다른 색깔이 나타나는 특징이 있는데, 단백질 중 빛에 반응하는 형광단백질을 뇌 기능 연구를 위해 활용한 것이다. 형광 단백질은 특정 파장의 빛에 각각 반응하여, 자기만의 고유한 파장의 빛을 내는 성질이 있다. 서로 다른 두 가지 형광단백질이 서로 충분히 가까운 거리 내에 적절한 방향으로 존재하면, FRET 반응이 일어나는데, 두 형광단백질 중 빛을 받는 단백질은 염소 이온과 결합이 가능하다.

※ FRET (fluorescence resonance energy transfer)반응 : 두 형광단백질에 빛을 쬐었을 때, 처음 반응이 일어난 하나의 형광단백질(공여자; donor)에서 발산된 파장의 빛에 의해 옆에 위치한 형광단백질(수용자; accepter)이 활성화되어 자신의 파장의 빛을 발산하는 현상

이러한 두 가지 형광단백질을 연결하면, 염소 이온의 존재 여부에 따라 발산하는 빛의 파장이 달라지는 센서로서 역할을 할 수 있다. 이러한 원리에 의해 고안된 센서단백질이 클로멜레온(Clomeleon)이다.

그러나 기존의 클로멜레온은

1) 신호 대 잡음비가 낮아 염소 이온 농도 측정에 많은 오차를 유발 할 수 있는 점,

2) 염소 이온 농도에 따른 FRET 비율의 변화 폭이 좁다는 점,

3) 기존의 기법으로는 클로멜레온을 만드는데 막대한 시간이 소요된다는 점에서 한계를 가지고 있었다.

어거스틴 박사는 Duke 대학교 Hellinga 박사 연구팀과 공동으로 단시간 내에 최적의 클로멜레온을 제작하는 단백질 제작 자동화로봇 시스템을 개발 하였고, 이를 이용하여 그 특성이 훨씬 향상된 새로운 염소 이온 센서 단백질, 슈퍼클로멜레온(SuperClomeleon)을 만들게 된 것이다.

슈퍼클로멜레온은 기존 클로멜레온에 여러 가지 돌연변이를 도입하여 다양하게 변형된 후보 단백질을 만들었다. 그 후, 여러 단계의 스크리닝 및 특성을 확인하는 시험 과정을 통해 기능을 확인하였다. 그 결과 기존의 전통적인 분자생물학적, 생화학적 방법으로는 한 번에 한 가지 돌연변이 단백질 밖에 만들 수 없었던데 비해, 새로운 자동화로봇시스템을 도입하여 384개의 돌연변이 후보 단백질을 단 한 번의 작동으로 만들 수 있게 되었다.

이러한 제작 공정의 획기적인 이점 외에도, 슈퍼 클로멜레온은 기존 클레멜레온에 비해 염소 이온 변화에 따른 FRET 비율의 변화폭이 2배이상 증가하였고, 높은 신호 대 잡음비를 얻을 수 있어 오차를 줄 일 수 있었다. 따라서 슈퍼클로멜레온을 이용하면, 훨씬 선명한 이미지를 통해 염소 이온의 농도 측정할 수 있고, 이를 통하여 높은 해상도의 억제성 신경회로망 규명이 가능하다.

 

 

<신경 세포 내에서 슈퍼클로멜레온(붉은 막대)은 기존의 클로멜레온(검은 막대)에 비해 향상된 높은 신호 대 잡음비를 보인다(최대 약 6 배).>

이처럼 특정 파장의 빛으로 활성이 조절되거나 혹은 특정한 이온, 막전위 등에 반응하여 빛을 내는 단백질을 신경세포 내로 도입하여, 뇌 회로를 연구하는 것이 광유전학(Optogenetics)기술이다. 본 연구는 센서단백질을 신경세포에 도입 및 발현시켜 신경세포 활성 여부를 광학 현미경을 통해 관찰했다. 이를 통해 얻어진 이미지를 분석함으로써 살아있는 쥐에서 특정부분의 뇌가 어떻게 작용하는지 효율적으로 파악할 수 있는 방법을 제시하였다.

 

본 연구는 복잡한 신경회로가 어떻게 기능하는지를 분석하는데 토대를 마련하고 특정 뇌질환 및 유전병의 원인 규명이 가능할 것으로 기대된다. 한 예로 뇌의 염소이온농도에 이상이 생길 경우, 체내에 점액이 과다 생산되는 낭포성 섬유증 같은 질환의 연구에 기술이 이용될 수 있다. 또한 각종 뇌 질환을 치료하는 약물 스크리닝 등에 폭넓게 활용할 수 있을 것이다.

 

KIST 조지어거스틴 박사는“이번 연구를 통해 최적의 단백질을 단시간 내에 제조하는 기술 개발에 성공하였고, 이를 광유전학 기술과 결합하여 뇌 활동을 이미지화하는 획기적인 신경기능 회로 연구의 토대를 마련했다”고 전하며, “국내 단백질 공학 수준을 한 단계 끌어올리는 계기를 마련했다”고 연구의의를 밝혔다.

 

 

○ 그림설명

 

<그림1> 슈퍼클로멜레온(SuperClomeleon)이 주입된 생쥐 신경세포에서 각각 다른 양의 염소이온 양이 측정되는 것을 시각적으로 보여준다. 염소 농도가 진해질수록 청색이 더 진해지는 것을 볼 수 있다.

 

 

 

 

 

<그림2> 화학적 시냅스의 작동원리. 전시냅스 세포 (presyanptic neuron)의 말단에서 분비된 신경전달물질 (neurotransmitter)는 후시냅스 세포 (postsynaptic neruon)의 수용체 (neurotransmitter receptor)에 결합하여 수용체를 활성화 시킨다. 활성화 된 수용체에서는 이온 통로가 개방되고, 이를 통해 이온에 이동하여 후시냅스 세포의 활성을 조절한다. 억제성 시냅스의 경우, GABA라는 신경전달물질이 분비되며, GABA 수용체가 활성화되면 염소 이온이 개방된 염소 이온 통로를 통해 신경 세포 내부로 이동하여 후시냅스 세포의 활성을 억제한다.

 

 

 

 

 

<그림3> 클로멜레온의 작동원리. 클로멜레온은 염소 이온에 결합하지 않는 공여자 형광단백질인 CFP와 결합할 수 있는 수용자 형광단백질 YPF로 구성되어 있고 이 두 형광단백질 간에는 FRET 현상이 일어날 수 있다. 염소 이온이 결합하지 않은 경우 클로멜레온은 YFP 파장의 빛이 주로 발산되고, 염소 이온이 결합한 경우에는 CFP 파장의 빛이 주로 발산된다. 두 가지 파장의 빛의 강도를 현미경을 통해 측정할 수 있고, 그 비율을 계산함으로써 신경 세포 내의 염소 이온의 농도를 알 수 있다.

 

 

 

<그림4> 슈퍼클로멜레온 자동화 장치 모습